Глюкозооксидазный метод определения глюкозы крови

Определение концентрации глюкозы в крови – одно из наиболее часто выполняемых биохимических исследований в КДЛ. Причина исключительной популярности теста связана с высокой заболеваемостью сахарным диабетом. Данный тест выполняется как в условиях стационара, так и в поликлиниках.

Больные сахарным диабетом вынуждены исследовать уровень глюкозы в крови в домашних условиях, поскольку без этой информации им трудно скорректировать свою диету, физические нагрузки, применение инсулина и других сахароснижающих препаратов.

Исключительная важность теста и большие объемы выполняемых исследований стимулировали разработчиков к созданию различных типов приборов и методов определения концентрации глюкозы в крови.

В настоящее время существует достаточно много методов определения глюкозы. Их можно классифицировать следующим образом.

1. Редуктометрические. Почти не используются 2. Колориметрические. Почти не используются

метрический по конечной точке

– отражательная фотометрия – сухая химия

Первые два метода крайне неудобны, токсичны и обладают низкой точностью, поэтому мы на них не будем останавливаться.

Сегодня наибольшее распространение получили методы, основанные на использовании фермента – глюкозооксидазы. В основе метода лежит следующая реакция:

Глюкозооксидаза катализирует перенос двух водородных атомов с первого углеродного атома глюкозы на кислород, растворенный в жидком реагенте. При этом в ходе реакции образуется в эквимолярных количествах перекись водорода. Т.е. концентрация образовавшейся перекиси водорода точно равна определяемой концентрации глюкозы.

Следовательно, использование глюкозооксидазной реакции, трансформировало задачу определения концентрации глюкозы в задачу определения концентрации перекиси водорода, которая, как будет показано ниже, значительно проще первой. И здесь есть несколько способов, широко используемых сегодня в лабораторной практике (см. схему).

Среди вышеперечисленных способов регистрации наибольшее распространение получил фотометрический биохимический метод, в котором молекулы перекиси водорода под действием фермента пероксидазы расщепляются с образованием активной формы кислорода – супероксид анион-радикала – О2-, который в свою очередь окисляет хромоген, что приводит к значительному изменению спектра поглощения хромогена.

На рис. 1 и 2 показаны спектры рабочего раствора до внесения в него стандартного раствора глюкозы и после. Максимум поглощения реакционной смеси – (реактив + глюкоза) находится в области 500 нм. Соответственно, изменение оптической плотности конечной реакции на длине волны 480-520 нм пропорционально концентрации глюкозы, содержащейся в пробе.

Рисунок 1. Спектр рабочего раствора

Рисунок 2. Спектр реакционной смеси (рабочий раствор + глюкоза)

Большая популярность данного метода определения глюкозы объясняется его высокой специфичностью и простотой выполнения. Метод можно реализовать как с применением обычного фотометра (лучше специализированного биохимического фотометра типа Микролаб 540), так и с помощью автоматических биохимических автоанализаторов.

Глюкозооксидазный метод признан сегодня одним из самых точных количественных методов определения глюкозы. В качестве биологического материала используется как сыворотка крови, так и цельная кровь. При работе с последней следует учитывать тот факт, что при взятии капиллярной крови доля сыворотки (плазмы) зависит от величины гематокрита, что может негативно отразиться на точности результата. Поэтому при определении глюкозы вышеописанным методом предпочтительно использовать сыворотку крови пациента.

Наряду с методом фотометрирования по конечной точке, несколько лет назад появились наборы, в которых реализован кинетический метод фотометрирования.

Суть метода состоит в том, что при определенном соотношении активностей глюкозооксидазы и пероксидазы, скорость образования окрашенного соединения некоторое время после внесения пробы в рабочий раствор будет пропорциональна концентрации глюкозы в пробе.

Преимущество такого метода состоит в том, что результат не зависит от наличия в пробе других соединений, поскольку поглощение последних стабильно во времени.

Этот метод требует применения кинетического фотометра, например Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, полуавтоматических анализаторов, например Clima 15, или автоматических биохимических анализаторов.

Измерение концентрации глюкозы из цельной крови удобно выполнять с помощью приборов, работа которых основана на амперометрическом принципе измерения, при помощи специальных ферментных датчиков. Перекись водорода является крайне нестабильным химическим соединением и она может служить источником заряженных частиц. Именно это и используется в ферментных датчиках мембранного типа или электрохимических элементах портативных глюкометров.

Рисунок 3. Измерительная ячейка

В измерительной ячейке, сконструированной как проточная, находится измерительная камера, с одной стороны ограниченная ферментной мембраной (Рис. 3). На мембрану толщиной около 60 микрон специальным образом сорбирована глюкозооксидаза. С другой стороны мембраны к ней прижимается платиновый электрод.

Проба цельной крови (обычно 20 мкл) разводится в системном буферном растворе (эритроциты разрушаются), после чего подается по магистрали в проточную ячейку. Глюкоза, подвергается окислению под воздействием фермента глюкозооксидазы, находящейся на мембране.

Образовавшаяся перекись водорода диффундирует через мембрану и окисляется далее в каталитической реакции под действием платины. Диффузия перекиси водорода на поверхность платины формирует ток, пропорциональный числу молекул Н2О2. Полученный таким образом сигнал обрабатывается прибором в соответствующее значение напряжения.

Это измеренное значение пропорционально концентрации глюкозы в пробы.

В качестве примера приборов, использующих вышеописанный метод можно назвать автоматические анализаторы глюкозы Biosen (Германия). Эти приборы удобны для использования не только в стационарах, но и в поликлиниках, где анализ на глюкозу делают преимущественно из капиллярной крови.

Важным этапом в развитии методов клинической лабораторной диагностики стало появление «сухой химии». Естественно, одним из первых приложений этой технологии стала задача определения глюкозы в крови пациента. Первые приборы значительно уступали по точности традицинным лабораторным методам исследований.

Однако, со временем, ряду фирм удалось разработать такие диагностические полоски и отражательные фотометры, которые обеспечили весьма высокую точность анализа.

Широко популярными во всем мире в настоящее являются глюкометры One Touch и тест-полоски к ним производства компании Life Scan (США), которые удачно сочетают в себе аналитическую точность количественного ферментативного метода со скоростью и простотой «сухой химии».

Глюкометры One Touchпредназначены для быстрого и точного измерения уровня глюкозы в цельной крови.

Тест-полоска One Touch содержит все необходимые химические компоненты для двухэтапного глюкозооксидазного метода, включая ферменты глюкозооксидазу и пероксидазу, которые сорбированы на уникальную пористую гидрофильную мембрану.

Результатом реакции является образование окрашенного комплекса. Интенсивность развившейся окраски регистрируется отражательным минифотометром.

Рисунок 4. Конструкция тест-полоски

В дополнении к этому, мембрана обладает гидрофильными свойствами, благодаря которым капля крови “притягивается” к поверхности тест-полоски при касании.Мембрана тест-полоск One Touch напоминает губку с микроскопическими порами и выполняет тройственную функцию.

Она действует: 1) как резервуар, собирая необходимое количество крови, 2) как фильтр, блокируя твердый клеточный материал (эритроциты, лейкоциты и др.), 3) как гладкая оптическая поверхность, на которой измеряется отраженный свет. Последняя функция, в частности, очень важна для работы прибора.

Она делает возможным считывать нижнюю часть полоски, тогда как кровь остается на верхней части тест-полоски. Соответственно, нет необходимости стирать (промокать) кровь с поверхности тест-полоски.

В состав приборов One Touch входит два специальных светодиода. Обработка развившейся окраски на тест-полоске идет следующим образом. Как только тест-полоска вставлена в прибор – происходит нулевое считывание. В этот момент на дисплее мы видим: “ЖДАТЬ”.

Когда капля крови наносится на тест-полоску, плазма крови моментально сорбируется мембраной, тогда как эритроциты и излишки плазмы остаются на поверхности мембраны. После полного впитывания капли крови немедленно происходит окрашивание. Прибор регистрирует изменение величины отражения и автоматически запускает таймер.

Через 45 секунд химическая реакция заканчивается, результат светоотражения обрабатывается. Окрашенный продукт реакции поглощает свет, испускаемый первым светодиодом. Форменные элементы крови и лишняя плазма также поглощают свет, излучаемый диодом. Чтобы скорректировать фоновое отражение, второе считывание производится вторым светодиодом на другой длине волны.

Разность сигналов от первого и второго светодиода несет информацию о поглощении света хромогеном. Сигнал, полученный от хромогена для оценки концентрации глюкозы, соотносится со специальной калибровкой. Все приборыOne Touch откалиброваны с использованием референтного метода на лабораторном анализаторе глюкозы.

С помощью этой процедуры получается стандартная калибровочная кривая. Отметим, что достаточно сложно наладить производство тест-полосок, которые были бы абсолютно одинаковыми химически, в силу очень низкой концентрации реактивов. Для решения этой проблемы используется стандартная калибровочная кривая, состоящая из 16 –ти калибровочных линий.

Контроль качества осуществляется сразу после производства тест-полосок, что позволяет определить, какая из калибровочных линий (от 1 до 16) может быть применена для данной тест-полоски. Это так называемый номер кода, который проставляется на упаковке тест-полосок. Эти 16 калибровочных линий также программируются в микропроцессоре прибора.

Для получения оптимально точных результатов, номер кода, указанный на упаковке тест-полосок выставляется в приборе при помощи кнопки кода. Таким образом, неправильно установленный код на приборе может являться причиной ошибки измерения.

С момента появления на рынке приборов One Touch прошло большое количество клинических исследований в лабораториях России, Америки и Европы. Одно из таких исследований было проведено Эндокринологическим научным центром РАМН по заказу Российской Ассоциации Медицинской Лабораторной Диагностики. Специалисты Центра провели сравнительный анализ двух методов измерения уровня глюкозы в крови.

Результаты, полученные на One Touch, сопоставлялась с данными, полученными на биохимическом анализаторе Spectrum II (Abbott Laboratories, США), реализующем гексокиназный метод определения глюкозы. Было исследовано 190 проб крови от 95 пациентов. Коэффициент корреляции результатов составил 0,98641.

Коэффициент вариации в нормальном и патологическом диапазонах на глюкометре One Touch не превысил 2,5%.

Рис. 5. Корреляционная зависимость показаний “One Touch” и «Спектрум-2» (коэффициент корреляции 0,98641)

В заключении следует упомянуть и о недостатках глюкозооксидазного метода.

Образующаяся перекись водорода и супероксид анион-радикал могут окислять не только хромоген, но и другие вещества, присутствующие в биологической жидкости: аскорбиновую кислоту, мочевую кислоту, билирубин.

При этом, соответственно, доля перекиси, принимающая участие в окислении хромогена, снижается, что приводит к занижению результата по глюкозе. Этот метод линеен, как правило, до 20-30 ммоль/л глюкозы.

В официальном отчете Эндокринологического научного центра РАМН сказано: «приборы One Touch обладают высокой точностью и правильностью, а также широким диапазоном измерений. Их можно использовать для диагностики неотложных состояний при диабете, в том числе бригадами “Скорой помощи”, поскольку эти приборы не только надежны, но и быстро дают результаты».

Гексокиназный метод состоит из двух последовательных реакций, но совершенно других:

Регистрация осуществляется при длине волны 340 нм по светопоглощению НАДН. Этот метод является высокоспецифичным и не дает реакции с другими компонентами сыворотки крови. Гексокиназный метод считается референтным для определения глюкозы. Как правило, он линеен до 50 ммоль/л, что позволило его широко рекомендовать для клиник с эндокринологическими отделениями.

Из описанного разнообразия методов определения глюкозы сотрудники КДЛ могут решить для себя, какой способ определения и какой прибор выбрать:

• Методы «мокрой» биохимии, реализованные на автоматических биохимических анализаторах, обеспечат нужды лабораторий с большим потоком анализов.
• Анализаторы глюкозы типа Biosen требуют от оператора минимальных трудозатрат, так как они полностью автоматизированы и достаточно производительны (скорость от 50 до 200 проб в час).
• Для лабораторий с небольшим числом исследований, а также экспресс-лабораторий удобен специализированный биохимический фотометр Микролаб 540.
• Для бригад скрой помощи идеальное решение – глюкометры типа One Touch.

Т.о., задача КДЛ обеспечить не только быстрое, но и высокоточное определение глюкозы, на сегодняшний день вполне решаема.

глюкозы в крови при определении глюкозооксидазным методом

Определение концентрации глюкозы в крови – одно из наиболее часто выполняемых биохимических исследований в лабораториях.

Глюкозооксидазный метод определения глюкозы в крови и моче основанн на реакции окисления глюкозы в присутствии фермента глюкозооксидазы с образованием перекиси водорода, которая в свою очередь в присутствии пероксидазы окисляет ортотолидин с образованием окрашенных продуктов; о концентрации глюкозы сулят по количеству окрашенных продуктов.

Поскольку глюкозооксидазный метод направлен на выявление именно глюкозы, а не всех видов сахаров, его применяют в дифференциальной диагностике следующих заболеваний:

Глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляет­ся кислородом воздуха с образованием в ходе реакции перекиси водорода.

Перекись водорода в присутствии фермента пероксидазы окисляет ортотолуидин образованием окрашенного соедине­ния, интенсивность окраски которого пропорциональна содержа­нию глюкозы.

Данный метод позволяет определить уровень глюкозы в плазме крови, сыворотке и спинномозговой жидкости.

— в плазме, натщесерце

• новорожденные — 1,7 — 4,2
• дети от 6 недель до 15 лет — 3,3 — 5,4
• взрослые (мужчины, женщины) — 3,9 — 5,6

— в сыворотке крови, натщесерце

• новорожденные — 2,6 — 4,2
• дети от 6 недель до 2 лет — 3,3 — 5,4
• взрослые (мужчины, женщины) — 3,9 — 5,6

1. Натрия хлорида 9 грамм/литр(изотонический раствор): готовят, раст­воряя 0,9 г NaCl в 100 мл воды.

2. Цинка сульфат, 50 г/л: 5 г сульфата цинка (ZnSO4) растворя­ют в воде, объем доводят до 100 мл.

3. Натр едкий, 0,3 моль/л: готовят, растворяя 1,2 г NaOH в 100 мл воды, концентрацию проверяют титрованием (она должна быть 0,3 н).

4. Ортотолуидин, 1%-ный раствор: 1 г препарата растворяют в 100 мл абсолютного спирта. Раствор можно хранить в холодиль­нике в склянке с притертой пробкой несколько месяцев. Имею­щийся в продаже препарат можно очистить перекристаллизацией, для чего его растворяют в абсолютном спирте, добавляют воду и выпавшие кристаллы отсасывают на фильтре, затем сушат над хлоридом кальция.

5. Ацетатный буферный раствор рН 4,8: смешивают 4 части 0,25 н уксусной кислоты (проверить титрованием) и 6 частей 0,25 н ацетата натрия (содержит 34 г CH3COONa X ЗН2О в 1 литре).

6. Глюкозооксидаза — сухой препарат активностью 3000 ед/мг или больше.

7. Пероксидаза из хрена. 1 мг растворяют в 5 мл ацетатного буфера, в холодильнике можно хранить не­сколько дней.

8. Рабочий реактив: в 80 мл ацетатного буфера растворяют 2 мг глюкозооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора ортотолуидина, перемешивают и доводят объем буферным раствором до 100 мл.

Рабочий реактив должен быть прозрачным, бесцветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в этом случае он устойчив при хранении на холоде.

Если же окраска интенсивна или через несколько часов после приготовления начи­нает выпадать осадок, это значит, что ортотолуидин недостаточ­но чистый и его надо перекристаллизовать.

9. Калибровочные растворы глюкозы. Глюкозу предваритель­но высушивают при температуре 37°С и хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего 180 мг вещества растворяют в 20 мл насыщенного раство­ра (примерно 0,3%-ного) бензойной кислоты.

Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 ммоль/л, для чего берут 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят насыщенным раствором бензойной кислоты до объема 10 мл.

Эти растворы содержат глюкозу в тех же концентрациях, в которых она бывает в крови, что облегчает расчеты при калибровке.

В центрифужные пробирки вносят 1,1 мл раствора хлорида натрия, 0,4 мл раствора сульфата цинка и 0,4 мл 0,3 н раствора NaOH, перемешивают; при этом образуется очень тонкий гель гид­рата окиси цинка, в него выпускают 0,1 мл крови или калибровоч­ного раствора, снова перемешивают и через 10 минут центрифуги­руют при скорости 3000 об./мин в течение 10 минут.

К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 3 мл рабочего реак­тива и осторожно перемешивают.

Постепенно начинает развиваться окраска, которая при обычной комнатной температуре достигает максимума через 13-15 минут, а затем постепенно умень­шается.

Фотометрируют всегда через один и тот же промежуток времени после добавления рабочего реактива в кюветах с длиной оптического пути 1 сантиметр с красным светофильтром (длина волны 625 нм) против холостого опыта, который ставят одновременно с рабочими пробами, но вместо крови берут физиологический раствор хлорида натрия.

При приготовлении калибровочного гра­фика вместо проб крови берут 0,1 мл соответствующего калибровочного раствора.

Расчет уровня глюкозы можно проводить по правилу пропорций или по калиб­ровочному графику, для построения которого на одной оси откла­дывают концентрацию глюкозы (ммоль/л), а на другой — величи­ну экстинкции.

1. Можно сначала выпустить кровь из пипетки в изотониче­ский раствор хлорида натрия, а затем добавить растворы сульфа­та цинка и NaOH.

2. При систематической работе нет необходимости постоянно строить калибровочный график по всем точкам, достаточно еже­дневно обрабатывать холостую пробу и 2-3 точки в диапазоне 3-9 ммоль/л, а полный калибровочный график строить лишь при смене реактивов или налаживании методики.

Глюкоза в крови

Определение глюкозы в крови – один из наиболее широко распространенных тестов в клинической лабораторной диагностике. Глюкозу определяют в плазме, сыворотке, цельной крови.

Согласно Руководству по лабораторной диагностике диабета, представленному Американской Ассоциацией диабета (2011 г.

), не рекомендуется измерять глюкозу в сыворотке крови при диагностике диабета, поскольку именно использование плазмы позволяет быстро центрифугировать образцы, чтобы предотвратить гликолиз, не дожидаясь образования сгустка.

Различия в концентрации глюкозы в цельной крови и плазме требуют особого внимания при трактовке результатов.

Концентрация глюкозы в плазме выше, чем в цельной крови, причем различие зависит от величины гематокрита, следовательно, использование некоего постоянного коэффициента для сопоставления уровня глюкозы в крови и плазме может привести к ошибочным результатам. Согласно рекомендациям ВОЗ (2006 г.

), стандартным методом для определения концентрации глюкозы должен быть метод определения глюкозы в плазме венозной крови. Концентрация глюкозы в плазме венозной и капиллярной крови не отличается натощак, однако через 2 ч после нагрузки глюкозой отличия существенны (Табл.).

Концентрация глюкозы, ммоль/л Цельная кровьПлазма венознаякапиллярнаявенознаякапиллярная

Натощак 3,3–5,5 3,3–5,5 4,0–6,1 4,0–6,1

Через 2 часа после ПГТТ 12,2

На уровень глюкозы в биологическом образце значительное влияние оказывает его хранение. При хранении образцов при комнатной температуре в результате гликолиза происходит существенное снижение содержания глюкозы.

Для ингибирования процессов гликолиза и стабилизации уровня глюкозы в пробу крови добавляют фторид натрия (NaF). При взятии образца крови, согласно докладу экспертов ВОЗ (2006 г.

), если немедленное отделение плазмы невозможно, образец цельной крови должен быть помещен в пробирку, содержащую ингибитор гликолиза, которую следует хранить во льду до выделения плазмы или проведения анализа.

Показания к исследованию

• Диагностика и мониторинг СД;
• заболевания эндокринной системы (патология щитовидной железы, надпочечников, гипофиза);
• заболевания печени;
• ожирение;
• беременность.

Особенности взятия и хранения образца.

Перед исследованием необходимо исключить повышенные психо-эмоциональные и физические нагрузки.

Предпочтительно – плазма венозной крови. Образец следует отделить от форменных элементов не позднее, чем через 30 мин после взятия крови, избегать гемолиза.

Образцы стабильны не более 24 ч при 2–8 °C.

Метод исследования.

В настоящее время в лабораторной практике наибольшее распространение получили ферментативные методы определения концентрации глюкозы – гексокиназный и глюкозооксидазный.

Повышенные значения

• СД 1 или 2 типа;
• диабет беременных;
• заболевания эндокринной системы (акромегалия, феохромоцитома, синдром Кушинга, тиреотоксикоз, глюкоганома);
• гемахроматоз;
• панкреатит острый и хронический;
• кардиогенный шок;
• хронические заболевания печени и почек;
• физические упражнения, сильное эмоциональное напряжение, стресс.

Пониженные значения

• Передозировка инсулина или гипогликемических препаратов у больных СД;
• заболевания поджелудочной железы (гиперплазия, опухоли), вызывающие нарушение синтеза инсулина;
• дефицит гормонов, обладающих контринсулярным действием;
• гликогенозы;
• онкологические заболевания;
• тяжелая печеночная недостаточность, поражения печени, вызванные отравлением;
• заболевания ЖКТ, нарушающие всасывание углеводов.
• алкоголизм;
• интенсивная физическая нагрузка, лихорадочные состояния.

Глюкозооксидазный способ определения глюкозы

Для определения концентрации исключительно глюкозы в различных жидкостях организма человека используют глюкозооксидазный метод. Преимуществом этого теста является его точность.

Диагностика в отличие от экспресс-методов позволяет выявить количество чистой глюкозы, без домеси к ней фруктозы и других сахаров. Принцип этой реакции заключается в окрашивании раствора, которое происходит вследствие взаимодействия окислителей со специфическими красителями.

Оценка результатов исследования проводится с помощью метода колориметрии и сравнения со стандартными растворами.

Этот тест используют для выявления нарушения толерантности к сахару и развития преддиабета, а также в стадии разгара болезни. Но для таких целей анализ используют редко, это связано с его высокой стоимостью и длительным ожиданием результата. Чаще всего определение глюкозы в крови и моче с помощью этого метода применяют при дифференциальной диагностике таких заболеваний, как:

• синдром непереносимости лактозы;
• непереносимость фруктозы;
• выделение фруктозы с биологическими жидкостями организма;
• повышенная концентрация пентозы в моче.

Несомненным достоинством глюкозооксидазного теста является его точность.

При окислении сахара кислородом происходит выделение перекиси.

Существуют различные методы определения концентрации глюкозы в крови, но глюкозооксидазный является наиболее точным. Подоснова его состоит в том, что при взаимодействии сахара с кислородом воздуха происходит окисление реагента. В раствор выделяется перекись водорода.

Это вещество взаимодействует с ортотолуидином, образуя окрашенное соединение. Для поведения этой реакции необходимо присутствие специальных ферментов. При реакции окисления должна присутствовать глюкозооксидаза, а при окрашивании жидкости — пероксидаза.

Интенсивность окраски раствора будет зависеть от содержания глюкозы и быть более всего интенсивной при высоком ее содержании.

Оценка результата происходит с помощью количественного метода фотометрии через один и тот же промежуток времени. Обязательно использование калибровочного раствора, который содержит определенную заявленную норму сахара и, отталкиваясь от нее, можно судить о концентрации глюкозы в выделяемых жидкостях организма, чаще в крови.

Забор материала от больного осуществляется натощак. Для проведения теста используют венозную кровь в количестве 5 мл. Накануне диагностики больному показана строгая диета.

Это позволит судить о достоверности результата и исключить возможные погрешности анализа. За 2 дня перед изъятием крови пациент должен отказаться от вредных привычек употребления алкоголя и курения.

Также необходимо ограничить прием чрезмерно сладких блюд и по возможности избегать стрессовых ситуаций.

Для получения плазмы с сахаром проводится центрифугирование крови.

Чаще всего этот метод определения концентрации глюкозы выполняют способом центрифугирования, которым выделяют форменные элементы. Количество сахара определяют уже в плазме. При добавлении к ней всех необходимых реагентов окраска наблюдается через 20 минут, если тест проводится при комнатной температуре. Расчет уровня глюкозы проводится по калибровочному графику или с помощью правила порций.

Для определения сахара наиболее удобно использовать экспресс-методы определения глюкозы в крови. Это объясняется простотой в использовании и быстрым получением результата.

Кроме этого, больному не нужно идти в лабораторию или больницу. Но в отличие от глюкозооксидазного теста такая диагностика является недостоверной.

Так как не дифференцирует глюкозу от других сахаров и определяет их концентрацию вместе. real6.ch

Основу глюкозооксидазной реакции составляет натрия хлорид 9% раствор и цинка сульфат 50%. Их добавляют на стадии центрифугирования крови. Кроме этого, используют буферный раствор с уксусной кислотой и ацетатом натрия.

Методом титрования определяют его рН на уровне 4,8.

После, добавляется глюкозооксидаза, из-за чего выделяется перекись водорода и пероксидаза, участвующая в окрашивании раствора до нужной концентрации для получения точного результата.

Измерение количества сахара происходит в специальных единицах — миллимолях на литр раствора.

Глюкозооксидазное исследование крови проходят обязательно на пустой желудок и используют для этого плазму или сыворотку. Норма количества ее для взрослых как для женщин, так и для мужчин составляет 3,3—5,5. Для детей до 15-ти лет этот показатель немного ниже и колеблется в пределах 3,2—5,3.

У новорожденных глюкоза крови составляет 1,7—4,2. Увеличение показателей наблюдается при развитии у больного сахарного диабета или при нарушении толерантности к глюкозе.

Это состояние является преддиабетом, и если его вовремя не лечить, то в скором времени оно приведет к развитию этой тяжелой патологии.

Определения глюкозы в крови

В норме уровень глюкозы в плазме или сыво­ротке натощак колеблется в пределах 70-110 мг% (3,9-6,1 ммоль/л).

Показатели в плазме или сыво­ротке надежнее, чем в цельной крови, так как не за­висят от гематокрита и отражают содержание глю­козы в интерстициальном пространстве, откуда ее получают ткани. Кроме того, плазма и сыворотка лучше подходят для автоматического анализа.

В этих средах отсутствуют форменные элементы, и поэтому концентрация глюкозы в них на 10-15% выше, чем в цельной крови.

Хотя в лабораториях анализ цельной крови на сахар проводят редко, больные диабетом в процессе самоконтроля ис­пользуют именно цельную капиллярную кровь. Недавно появились модифицированные рефлекто­метры, прямо показывающие уровень глюкозы в сыворотке, что лишает больного и врача необхо­димости производить расчеты.

Кровь собирают в пробирки с фторидом натрия, предотвращающим гликолиз, из-за которого уро­вень глюкозы может оказаться заниженным. В от­сутствие таких пробирок пробы крови сразу же (не позднее 30 минут) центрифугируют, и плазму или сыворотку хранят при 4°С.

В лабораториях содержание глюкозы в плазме обычно определяют ферментативными (глюкозо- оксидазным или гексокиназным), колориметриче­скими (а-толуидиновым) или автоматическими методами.

Последние основаны на восстановлении соединений меди или железа сахарами сыворотки после ее диализа.

При всем удобстве автоматиче­ских методов они не специфичны для глюкозы, так как реагенты взаимодействуют и с другими восста­навливающими веществами (содержание которых повышено при азотемии и при высоком потребле­нии аскорбиновой кислоты).

Измерения глюкозы в капиллярной крови, про­изводимые самим больным в домашних условиях, имеют важнейшее значение. У больных сахарным диабетом 1 типа, пытающихся осуществлять жест­кий контроль гликемии, такие измерения совер­шенно обязательны.

Содержание глюкозы в капил­лярной крови определяют с помощью тест-полосок (пропитанных глюкозооксидазой, глюкозодегид- рогеназой или гексокиназой), помещая их в глюко­метр или амперметр. В настоящее время выпуска­ется множество таких приборов.

Все они достаточ­но точны, но различаются скоростью работы, необходимым объемом крови и ценой. Лучшие из них требуют всего 0,3 мл крови и выдают резуль­тат меньше чем через 7 секунд.

Более дорогие моде­ли снабжены компьютером, вычисляющим сред­ние показатели, и, будучи присоединенными к принтеру, записывают показания в цифровой или графической форме. Для прокола пальца использу­ют специальный ланцет — иглу 28-30 калибра (во врачебных кабинетах и больницах пользуются сменными иглами).

Существуют и модели для оп­ределения уровня глюкозы в пробах крови, взятых не из пальца, а из других мест (предплечье, бедро). Однако быстро развивающаяся гипогликемия регистрируется в крови из предплечья на 5-20 минут позднее, чем в крови из пальца.

Клиницист должен знать о возможных погреш­ностях измерения глюкозы при самоконтроле. Во-первых, ряд старых глюкометров калиброваны по уровням глюкозы в цельной крови, а тест-полос- ки реагируют на глюкозу в плазме. Поэтому показа­ния таких приборов следует увеличить на 10-15%.

Во-вторых, увеличение или снижение гематокрита соответственно снижает или повышает результаты измерений. По-видимому, эритроциты препятству­ют диффузии плазмы в слой реагентов. В-третьих, глюкометры и тест-полоски рассчитаны на колеба­ния концентрации глюкозы в пределах 60-160 мг%, и при больших или меньших ее концентрациях точ­ность измерений может снижаться на целых 20%.

В-четвертых, при высоком напряжении кислорода в крови амперометрические системы, основанные на глюкозооксидазном методе, занижают концен­трацию глюкозы, и если больной дышит кислоро­дом, лучше использовать системы, основанные на глюкозодегидрогеназном методе.

Самоконтроль требует обучения больных приемам отбора проб крови и правилам измерения, а также точной калиб­ровки используемых приборов. В клиниках необхо­димы строгий контроль качества анализов и квалификации персонала лабораторий.

В настоящее время существуют системы, позво­ляющие непрерывно контролировать уровень глю­козы с помощью подкожно введенного сенсора (сходного с канюлей инсулиновой помпы).

Такие системы регистрируют концентрацию глюкозы в интерстициальной жидкости на протяжении 72 часов, сразу же сигнализируя об опасном сниже­нии или повышении уровня сахара. Во избежание ошибки результаты измерений рекомендуется про­верять путем определения концентрации глюкозы в капиллярной крови.

В системах другого типа интерстициальная жидкость экстрагируется из непо­врежденной кожи методом обратного ионтофореза (слабым электрическим током). При этом возможно раздражение кожи; кроме того, повышенная потли­вость искажает результаты измерений.

Все эти сис­темы требуют калибровки по содержанию глюкозы в крови из пальца. Они особенно полезны для выяв­ления эпизодов бессимптомной гипогликемии в ночное время.

Определение глюкозы глюкозооксидазным методом

Определение концентрации глюкозы в крови – одно из наиболее часто выполняемых биохимических исследований в лабораториях.

Глюкозооксидазный метод определения глюкозы в крови и моче основанн на реакции окисления глюкозы в присутствии фермента глюкозооксидазы с образованием перекиси водорода, которая в свою очередь в присутствии пероксидазы окисляет ортотолидин с образованием окрашенных продуктов; о концентрации глюкозы сулят по количеству окрашенных продуктов.

Поскольку глюкозооксидазный метод направлен на выявление именно глюкозы, а не всех видов сахаров, его применяют в дифференциальной диагностике следующих заболеваний: